Soil Enzymes and Their Research Methods
Instrument & Consumables
Name
Origin
Price
Web
Reference
(Now) KHB ST-360 Automatic ELISA Microplate Reader
China
20K RMB
(Hope) Shanpu (Flash) SuPerMax 3100 Multimode Reader
China
600K RMB
(Hope) Molecular Devices SpectraMax iD3 Multimode Reader
US
N/A
N/A
Soil Enzyme Activity
EC 3.2.1.38 - β-D-Fucoside - β-D-岩藻糖苷酶
CAS
Name
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Web
1226-39-7
pNP -β-D-Fucopyranoside443RMB/50mg
https://doi.org/10.1007/s00374-020-01482-9
Abstract
土壤中β-D-岩藻糖苷酶活性的定量分析
包含动力学参数和热力学参数，实验梯度可参考
EC 3.2.1.91 - β-1,4-Cellobiosidase - β-1,4-纤维二糖苷酶
CAS
Name
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Web
3482-57-3
pNP -β-D-Cellobioside4498RMB/1g
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2023.106861
Abstract
该酶活性的最佳 pH 值和温度分别约为5.5和60°C
包含动力学参数测定，实验可参考
EC 3.4.11.1 - Leucine Aminopeptidase - 亮氨酸氨基肽酶
CAS
Name
Price
Web
4178-93-2
L-Leucine-p-nitroanilide
238RMB/1g
https://doi.org/10.1002/saj2.20255
Abstract
对硝基苯胺底物浓度为对硝基苯基浓度的1/5（备注：实际浓度应使用酶促反应动力学方法研究，但因条件受限使用文章比例）
EC 3.4.11.2 - Arylamidase - 芳基酰胺酶
CAS
Name
Price
Web
893-36-7
L-Leucine b-naphthylamide hydrochloride
1110RMB/1g
893-36-7
L-Leucine b-naphthylamide hydrochloride
1083RMB/1g
https://doi.org/10.1016/S0038-0717(00)00109-7
Abstract
以L-亮氨酸β-萘基酰胺为底物时，所释放的β-萘胺可从土壤中被定量提取；产生的β-萘胺先用乙醇提取，再与对二甲氨基肉桂醛反应生成偶氮化合物，并在540nm波长处测定其吸光度
Method
https://doi.org/10.1002/agg2.20405
Danger
土壤酶活性所代表的意义以及如何正确或错误地解读这些活性
目前对土壤酶如何催化养分元素的水解或氧化反应仍缺乏深入理解：（1）酶不仅来源于微生物，也可能由植物产生，仅凭土壤酶活性无法推断土壤微生物活动，也无法据此判断微生物对养分的限制或需求；（2）忽视了酶促反应的所有产物均含有一定量的碳：仅凭β-葡萄糖苷酶活性无法全面表征所有参与碳循环的酶，更遑论完整地刻画土壤碳循环；NAG 是水解以氨基糖为骨架的聚合物，最终释放出碳氮摩尔比为 6:1 的产物；（3）土壤水解酶（如 NAG ）是胞外酶：将胞外酶活性用作微生物“生长与活性”的替代指标是不恰当的；某一特定土壤中的磷酸单酯酶（PME ）活性会沿着整个 pH 梯度呈现出难以预测的变化规律
大多数酶并不“矿化”营养元素：矿化是指将营养元素的有机形态最终转化为无机形态的过程；大多数酶属于水解酶类，并不直接参与化合物的矿化，而是通过降解聚合物来发挥作用；酶并不代表释放植物可利用形态的最终步骤，只是反映了该化合物可能的降解速率
事后归因式的解释：宏观尺度过程与编码酶的基因之间所假定的关联在很大程度上并不可靠；酶既可促进碳封存，又可导致碳矿化，这二者如何并存？底物对酶活性的诱导作用可以与产物的反馈抑制同时发生。酶活性可以且确实会被同时以截然相反的方式解读。
相关性并不意味着因果关系，也并不等同于生物物理层面的共定位现象：仅凭相关性不足以解读任何土壤健康指标的功能意义；土壤酶谱学方法已明确揭示了土壤有机质与酶活性之间的生物物理脱钩现象
认为土壤酶活性数据应当“简便、经济、易行”的假设，充其量值得商榷，最坏的情况则会危及数据质量；为何不先确认在底物充足的情况下，酶活性确实已接近最大值，从而避免在不同处理间出现假阴性结果呢？（理解：需优先进行酶促反应动力学试验）
para -Nitroaniline (pNA )
https://doi.org/10.1002/ael2.20079
Abstract
pNA 吸光度最大吸收峰位于379nm，不随 pH 变化而改变，无需进行碱化处理；碱化会加剧 pNA 底物的非生物水解亮氨酸氨肽酶、甘氨酸氨肽酶
https://doi.org/10.1016/j.geoderma.2023.116703
Abstract
蛋白质，又称肽链，是由氨基酸组成的长链聚合物，首先被分解为较短的寡肽，进而转化为游离氨基酸，供土壤微生物直接利用；随后，这些游离氨基酸还可进一步脱氨，释放出铵态氮（N），供微生物和作物吸收。
Note
使用 pNA 测定氨肽酶的方法：于50mL离心管中，放入相当于1g烘箱干燥土样的鲜土，与5mL 1mM pNA底物溶液混合，在37°C孵育24h，反应终止时加入4mL 0.1M pH12 Tris缓冲溶液以回收产物，并加入1mL 2M CaCl2 溶液使沉积物絮凝；Tris缓冲溶液用于提高产物的提取效率并避免氨肽酶底物发生非生物水解；离心后在380nm测定pNA吸光度。
本文中对照 pNP 测定BG方法：底物10mM，孵育时间1h。
https://doi.org/10.1002/saj2.20663
Abstract
Note
使用 pNA 测定氨肽酶的方法：称取1g风干土壤样品，与5mL MUB缓冲液溶解的2mM 底物溶液混合，在37°C孵育24h，反应终止时加入4mL 0.1M pH12 Tris缓冲溶液以回收产物，并加入1mL 2M CaCl2 溶液使沉积物絮凝
para -Nitrophenol (pNP )
https://doi.org/10.1007/s11356-021-17173-3
Abstract
https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2021.108245
Abstract
酯类底物的非生物水解程度最低，酰胺类底物的非生物水解程度最高
对硝基苯酚（pNP ）和对硝基苯胺（pNA ）底物在测定中使用0.1M Tris缓冲液代替0.5M NaOH进行碱化处理
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2016.12.013
Abstract
土壤酶活性通常通过将缓冲液处理过的土壤悬浊液与显色或荧光底物类似物共同孵育来测定，随后定量测定释放出的显色或荧光产物，并根据孵育时间进行校准。
对硝基苯酚在pH<5.6时无色，而在pH>7.6时呈黄色。
MUF在NaOH存在下并不稳定，必须在几分钟内完成检测。
4-Methylumbelliferyl (MUF )
https://doi.org/10.1016/j.foreco.2025.122651
Abstract
即使采用荧光底物测量，20cm以下土层的风干土壤酶活性极低
Factor
Soil Seedbank - 土壤种子库
https://doi.org/10.1017/S0960258518000181
Abstract
种子防御酶——多酚氧化酶、过氧化物酶、几丁质酶和草酸氧化酶
Derivation
Ecoenzymatic Stoichiometry - 生态酶化学计量
https://doi.org/10.1016/j.geoderma.2022.116242
Danger
题目：酶学视角下的 C:N:P 化学计量比：推断土壤微生物养分限制的可疑假设与内在不一致性
酶化学计量比基本假设：当某种养分严重受限时，土壤微生物会更多地将资源用于胞外酶的合成，以获取更为稀缺的养分，因此微生物对不同养分的相对限制程度可通过各类酶活性的比值来反映。
酶化学计量法是否确实能够准确判定微生物的养分限制的质疑观点：（1）一种酶可能参与多种元素的获取：酶化学计量法假设每种特定酶仅用于获取单一元素，然而在实际环境中同一种酶可能参与多种元素的释放。NAG 和 LAP 均可能用于碳的释放；磷酸单酯酶同样可能参与碳的释放过程。（2）多种酶可能参与同一种元素的获取：胞外土壤酶催化着土壤有机质周转过程中一个可能的限速步骤，它们调控着可同化的小分子寡聚物和单体从蛋白质、木质素或碳水化合物等更复杂的高分子中释放出来；根据生态系统中土壤有机质的分子组成，有机聚合物的酶促降解可能需要数十种不同的酶；某些酶的合成会响应特定底物的存在而发生，与产物对酶合成的反馈抑制作用相反；从木质化纤维素中通过酶解释放碳，首先需要降解木质素，而这一过程所需的能量消耗显然高于非木质化纤维素，因为前者需要更广泛的氧化性和水解性释碳酶共同参与。（3）生物因子对土壤系统中总酶库的贡献尚不明确：植物根系分泌的蛋白酶或磷酸酶等胞外酶；来自落叶凋落物或穿透雨的酶；尚无法区分土壤中所测得的胞外酶活性的具体来源；添加富含碳的植物材料导致土壤真菌和细菌产生不同的酶学响应。（4）由酶促反应化学计量学方法不一致所引起的额外不确定性：即使在自然生态系统的稳态条件下，土壤微生物仍可能受到某些元素的限制。
结论：基于酶化学计量学的方法无法用于推断土壤微生物的养分限制状况。将酶化学计量比作为一种间接指标；将更多相关酶纳入该化学计量框架。
https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2025.109886
Abstract
对 https://doi.org/10.59717/j.xinn-geo.2024.100048 的批判性意见
为何在设定阈值时，要将自然样品假定为资源不受限，而在将酶化学计量学方法应用于单个样品时，却又认为它们受到特定元素的限制？
该模型可能会过度简化复杂的生物化学途径，从而限制其在预测不同底物类型下营养物质获取动态方面的准确性。
https://doi.org/10.1002/advs.202510549
Abstract
使用 pNP 和 pNA 底物，测定酶活性并计算酶化学计量和微生物碳利用效率
注意：其文内存在部分错误，在 pNA 测量时应使用 380nm
https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2023.108997
Abstract
酶化学计量关系在量化土壤微生物群落对资源的利用效率及资源限制方面已被质疑 。
微生物对可溶性资源的利用在分钟至小时内完成，对聚合性资源的利用依赖于细胞外酶的产生和周转，需数天至数周。
矿物养分、植物和微生物分泌的小分子代谢物在被微生物同化之前并不需要经过胞外催化过程。
需区别通过酶化学计量法估算的土壤群落碳利用效率（CUEST ）与基于标记底物同化法估算的碳利用效率（CUE）。
生态酶化学计量反映微生物从聚合底物中相对获取碳、氮和磷资源的情况，其获取量能够平衡微生物的化学计量需求，同时考虑元素同化效率与资源可用性。
BG、LAP 、NAG 、AP催化了最丰富的碳、氮、磷聚合物的末端水解反应，生成可溶性产物以共微生物吸收利用。不同的分类单元仅能产生降解植物和微生物生物质所需一组酶的部分酶，需要不同分类群协同共生以维持群落生产力。
对易利用底物添加的响应（SIR）往往与酶活性测定（EEA）不一致。酶化学计量很难准确预测土壤微生物群落对快速增加的易获取资源所做出的即时响应。
土壤微生物群落在即时（小时，如呼吸和生长）、中期（数天，如生长和酶分配）、长期（数周，如酶分配）对资源可利用性的响应难以相互关联，因为群落的不同组成部分对不同资源的响应存在显著差异。
生态酶化学计量方法适用于评估自然生态系统中微生物资源限制的长期变化规律 ，自然生态系统中植物来源的复杂有机物是微生物获取能量和营养的主要来源；在受干扰生态系统或培养或养分输入实验中使用该方法需谨慎。
https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2022.108910
Abstract
https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2022.108613
Abstract
酶化学计量比可反映森林土壤中微生物的资源限制、底物质量，或二者兼而有之。
区别凋落物的碳源：如果纤维素是相对于几丁质、肽聚糖和蛋白质而言最主要的微生物碳源，则BG/NAG比值将符合生态酶计量理论；反之微生物主要以有机氮化合物来获取碳，则理论不成立。
https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2021.108363
Abstract
NAG 的底物是几丁质或肽聚糖，是分解后期产物；BG/NAG比例变化反映分解阶段的不同；BG/NAG比例与多酚氧化酶活性呈负相关佐证此结论。
https://doi.org/10.1016/j.foreco.2020.118880
Abstract
中国北方落叶松人工林中，间伐措施与季节类型对土壤生态酶化学计量比及微生物资源限制的影响
使用 pNP 和 pNA 底物进行测量并计算酶化学计量指标
Reference
ISO 20130:2018
Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using colorimetric substrates in micro-well plates
ISO/TS 22939:2019
Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates